تعتبر تقنية الكروماتوغرافيا السائل عالية الدقة HPLC من أهم تقنيات الفصل الكيميائي بين المواد، وأكثرها شيوعا في مختلف الصناعات ومجالات البحث المختلفة ولذلك جمعنا ليكم فى موقع « علومنجى دوت كوم » ادق المعلومات العلمية اللى بتخص التقنيه دى ، تتمايز أنواعها بتنوع طوريها الحامل (the mobile phase) والثابت (the stationary phase).
أولا الشرح صوت وصورة
الجزء الاول من الكورس صوت وصورة
الجزء الثانى من الكورس
ثانيا الشرح داتا
الشرح العربى
من بين أنواع الكروماتوغرافيا نجد كروماتوغرافيا السائل عالية الدقة (HPLC) وكروماتوغرافيا الغاز (GC). في هذا المقال سنتطرق بالأساس لكروماتوغرافيا السائل (HPLC) وسنقوم بتعريف مبسط وموجز لهذه التقنية، عناصرها وكيفية عملها.تعريف HPLC؟
ذكرنا سابقا بأن أنواع الكروماتوغرافيا تتعدد بتعدد أنواع الطور الحامل و الثابت. فكروماتوغرافيا السائل عالية الدقة تعتمد في عملها على طور حامل سائل لهذا سميت بهذا الاسم. تستخدم هذه التقنية لتحديد هوية المركبات والسوائل ذات درجات الغليان المرتفعة (أي التي تملك وزن جزيئي مرتفع نسبياً) وتعتمد آلية الفصل على درجة التوزع للمحلول الحاوي على المركب المدروس بين الطور الحامل (السائل) والطور الثابت الموجود ضمن العمود. تحتاج كروماتوغرافيا الـ HPLC ضغطاً عالياً (5000-6000) 1psi وقد تصل في كروماتوغرافيا الـ UHPLC حتى (18000) psi. أما في الكروماتوغرافيا الغازية فيحتاج الى ضغوط منخفضة (150-200) psi.
طور هذا الجهاز في أواخر السبعينيات ولقي اقبالا كبيرا من لدن الباحتين كوسيلة للفصل وتحليل المواد الكيميائية في العديد من المجالات. في الشكل الاتي نموذج مبسط لجهازHPLC .
مكونات جهاز ال HPLC يتكون هذا الجهاز من سبعة مكونات أساسية
نظام توصيل المذيب (Pumpe): هو مضخة لضمان السريان الحر للطور الحامل بشكل مستمر ودقيق
نظام إدخال العينة (Injector) : يمكن ان يكون إلي أو يدوي ويستخدم صمامات . عند فتحها يمكن ملا تجويف العينة بحجم من 10 إلى 50 ميكرو لتر. وعند غلق الصمامات تذهب العينة الى مجرى الطور الحامل ذي الضغط العالي حيث ترسل الى العمود ليتم تحليلها.
وعاء الطور الحامل: هو دورق يشترط فيه ان يكون نقيا نظيفا مفرغا من الهواء والغازات، تفاديا للخطأ في التحليل.
العمود (Column): هو قلب الجهاز حيث تحدث عملية الفصل. عادة ما يكون مصنوعا من الفولاذ غير قابل للصدأ ومضاد للتآكل وينقسم إلى نوعين: أعمدة تحليلية وأخرى أولية.
الكاشف (the detector) : وظيفته مراقبة المواد المذابة المراد استخلاصها عند خروجها من العمود، فهو يبعث اشارات كهربائية تتناسب مع مستوى خاصية معينة لدى مادة الطور الحامل. من بين الكواشف المستخدمة في الكروماتوغرافيا السائلة العالية الأداء (HPLC):
كاشف الأشعة فوق االبنفسجية UV يعتبر الأكثر شيوعاً بين الكواشف.
الصمام الثنائي الضوئي (Photodiode).
كاشف الفلوريسينس (Fluorescence): عالي الانتقائية والحساسية يستخدم عادة للكشف عن المركبات المتشكلة اثناء حدوث تفاعلات متسلسلة.
كاشف الانكسار الضوئي (Refractive index): كاشف عام يمتلك حساسية محدودة.
كاشف الناقلية: جيد الانتقائية والحساسية.
جهاز الحاسوب: يستخدم كجهاز مجمع للبيانات حيث يكون متصلا بالكاشف فيلتقط الاشارات الالكترونية الاتية منه ثم يقوم بتحليلها واخراحها في شكل رسوم تسمى كروماتوغرام .
كيفية عمل HPLC
تتم اذابة المركبات الكيميائية المراد فصلها في مذيب حيث يتم ادخال هذا الخليط في ا لطور الحامل وبالاعتماد على طبيعة الجزيئات، فإنها تتفاعل اكثر او اقل مع الطور التابث الموجود في الانبوب المسمى بالعمود الكزوماتوغرافي (chromatography column).
كروماتوغرافيا السائل عالية الدقة (HPLC) هي طريفة تمزج بين ماهو فزيائي وما هو كيميائي وتعتمد بالاساس على الاختلاف والتنوع في التفاعلات بين المذاب، ا لطور الحامل والطورالتابث. نتيجة لهذه التفاعلات يحصل الفصل المطلوب.
حيث يتم بداية ضخ الوسط المتحرك داخل العمود باستخدام مضخة تستطيع ذات ضغط عالي ومن ثم يتم حقن العينة المراد فصلها من خلال حاقن، لتنتقل العينة الى العمود، حيث تتم عملية الفصل ويقوم الكاشف باعطاء اشارة لكل مكون من مكونات العينة ، لتظهر النتيجة على هيئة كروماتوغرام , ادا نجح الفصل فكل ذروة (pic) يمثل مكونا من الخليط المراد فصله .كل الذروات pics المسجلة تسمى او يطلق عليها كروماتوغرام . للحصول على نتيجة ممتازة يجب تطبيق ضغط عال يفوق bars 100 .
على مستوى العمود يتم توزيع المركبات في المحلول وفقا للانسجام بين الطور المتحرك والطور الثابت.
تعرفنا سابقا ان جهاز ال HPLC يقوم بفصل مكونات العينة ثم التعرف عليها ويتم الفصل عن طريق توزيع العينة ما بين الوسط المتحرك ويكون سائل والاخر ثابت ويكون سائل او صلب .يمكن تقسيم الكروماتوغرافيا حسب نوع القوى المسؤولة عن الفصل الى ثلاثة انواع سنقوم بتعريف كل واحدة على حدة :
كروماتوغرافيا الأيونية (Ion-exchange chromatography )
يتميز هذا النوع بكون الطور الثابت عبارة عن مبادل للأيونات سواء تعلق الامر بالأنيونات او الكاتيونات حيث يتفاعل المحلول الأيوني مع الشحن الموجودة في الطور الثابت للجهاز HPLC وتتم عملية الكشف عبر القياسات التوصيلية .
كروماتوغرافيا الأحجام (Excluding chromatography )
هذا النوع ينطبق على الأنواع ذات الحجم الجزيئي الكبير، بحيث المحلول المراد فصل مكوناته يكون مرتبطا بالكتلة المولية (masse molaire ).
كروماتوغرافيا الانجذاب (ِAffinity chromatography)
تقوم هذه التقنية على كون الطور الثابت يتكون من اجسام او مثبتات او عادة اي مواد تستطيع الارتباط بشكل انتقائي بالجزيئات المراد تحليلها من العينة حين مرورها، حيث تستطيع هذه الجزيئات الانجذاب او الارتباط مع تلك الاجسام او المثبتات ويتم احتجازها في العمود تبعا لدرجة انجذابها .
------------------------------------------------
الشرح الأنجليزى
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)
is a separation technique that involves
- the injection of a small volume of liquid sample
- into a tube packed with tiny particles (3 to 5 micron (μm) in diameter called the(stationary phase)
- where individual components of the sample are moved down the packed tube (column) with a liquid (mobile phase) forced through the column by high pressure delivered by a pump.
- These components are separated from one another by the column packing that involves various chemical and/or physical interactions between their molecules and the packing particles.
- These separated components are detected at the exit of this tube (column) by a flow-through device (detector) that measures their amount. An output from this detector is called a “liquid chromatogram”.
The 5 major HPLC components and their functions
1. Pump
The role of the pump is to force a liquid (called the mobile phase) through the liquid chromatograph at a specific flow rate, expressed in milliliters per min (mL/min).
Normal flow rates in HPLC are in the 1-to 2-mL/min range.
Typical pumps can reach pressures in the range of 6000-9000 psi (400-to 600-bar).
During the chromatographic experiment, a pump can deliver a constant mobile phase composition (isocratic) or an increasing mobile phase composition (gradient).
2. Injector
The injector serves to introduce the liquid sample into the flow stream of the mobile phase.
Typical sample volumes are 5-to 20-microliters (μL).
The injector must also be able to withstand the high pressures of the liquid system.
An autosampler is the automatic version for when the user has many samples to analyze or when manual injection is not practical.
3. Column
Considered the “heart of the chromatograph” the column’s stationary phase separates the sample components of interest using various physical and chemical parameters.
The small particles inside the column are what cause the high backpressure at normal flow rates.
The pump must push hard to move the mobile phase through the column and this resistance causes a high pressure within the chromatograph.
4. Detector
The detector can see (detect) the individual molecules that come out (elute) from the column.
A detector serves to measure the amount of those molecules so that the chemist can quantitatively analyze the sample components.
The detector provides an output to a recorder or computer that results in the liquid chromatogram (i.e., the graph of the detector response).
5. Computer
Frequently called the data system, the computer not only controls all the modules of the HPLC instrument but it takes the signal from the detector and uses it to determine the time of elution (retention time) of the sample components (qualitative analysis) and the amount of sample (quantitative analysis).
Types of Chromatography
1) Adsorption Chromatography :-
Chromatography in which separation is based mainly on differences between the adsorption affinities of the sample components for the surface of an active solid.
2) Partition Chromatography :-
Chromatography in which separation is based mainly on differences between the solubility of the sample components in the stationary phase (gas chromatography) , or on differences between the solubilities of the components in the mobile and stationary phases (liquid chromatography).
3) Ion Exchange Chromatography :-
Chromatography in which separation is based mainly on differences in the ion-exchange affinities of the sample components.
Anions like SO3- or cations like N(CH3)3+ are covalently attached to stationary phase, usually a resin.
4) Molecular Exclusion Chromatography :-
A separation technique in which separation mainly according to the hydrodynamic volume of the molecules or particles takes place in a porous.
non-adsorbing material with pores of approximately
the same size as the effective dimensions in solution of the molecules to be separated.
5) Affinity chromatography :-
The particular variant of chromatography in which the unique biological specificity of the analyte and ligand interaction is utilized for the separation.
👍👍👍👍
ردحذف